ELISA技術的“自我認知”

有臨
2021.07.16
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ELISA是酶聯免疫吸附實驗( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的簡稱。它是繼免疫熒光和放射免疫技術之后發展起來的一種免疫酶技術。此項技術自70年代初問世以來,發展十分迅速,目前已被廣泛用于生物學和醫學科學的許多領域。在臨床檢驗中主要通過抗原抗體反應檢測體液中的抗體或抗原性物質。


原理:測定時,受檢標本與固相載體表面的抗原或抗體起反應,用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與溶液中的其他物質分開,再加入酶標記的抗原或抗體,也通過反應結合在固相載體上,加入酶反應的底物后,底物被酶催化成有色產物,產物的量與標本中要檢測的目標物質的量直接相關,故可根據顏色的深淺進行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高,間接地放大了免疫反應的結果,使測定方法達到很高的靈敏度。主要從以下幾個部分介紹:


一、各種不同的ELISA檢測類型


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二、ELISA不同研究領域的應用


ELISA技術是特定靶標蛋白質定量的金標準,提供快速、穩定且易于分析的結果。ELISA可用于研究領域中的許多靶標:


1)細胞因子、趨化因子和生長因子:細胞因子(cytokine,CK)是細胞經刺激活化后,分泌的一類具有高活性的小分子蛋白質,細胞因子是介導細胞間信息傳遞,參與免疫細胞分化發育、免疫應答、免疫調節及炎癥反應的重要免疫分子。


細胞因子不僅與免疫狀況和炎癥反應有關,而且還與神經退行性疾病和癌癥等疾病有關??蓽蚀_定量血清、血漿和組織培養上清液中的細胞因子,從而使研究人員能夠充分了解生理條件下疾病的發病機制。



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2)腫瘤免疫學:許多藥物的研究策略都是針對免疫檢查點標記物來增強抗腫瘤的免疫性。免疫檢查點是維持正常免疫反應和保護組織免受免疫激活損傷的重要細胞途徑。癌細胞免疫檢查點失調,并將其用作免疫抵抗的機制。例如,PD-1使癌細胞免受T細胞識別,從而防止了T細胞的攻擊;CTLA-4在抗原提呈細胞引發T細胞的過程中發揮作用,抗體阻斷CTLA-4受體可激活T細胞,從而產生抗癌免疫反應。


3)神經生物學:ELISA能夠定量多種生物學來源的蛋白質,包括多種物種的血清,血漿和CSF(腦脊液)。


- 淀粉樣蛋白β(Aβ,β淀粉樣蛋白或Abeta):與阿爾茨海默病有關,是阿爾茨海默病患者大腦中淀粉樣斑塊的主要成分。


- Tau:是一種穩定的微管蛋白,如果不能正常發揮功能,則可能與神經系統的病理和癡呆有關。


- α突觸核蛋白(α-突觸核蛋白):在維持突觸前末端突觸小泡的供應中起重要作用,也可能有助于調節多巴胺的釋放。


4)磷酸特異性:真核細胞中大約30%的蛋白經過磷酸化修飾,調控細胞活性,包括細胞周期、分化、代謝和神經元通訊。而異常的磷酸化狀態涉及許多人類疾病,包括癌癥。研究關鍵蛋白質靶標的磷酸化和翻譯后修飾對于更好地了解疾病背后的機制至關重要。其中ELISA已逐漸成為測定蛋白磷酸化的一種有力方法,為研究信號通路中涉及的細胞內蛋白的研究人員提供了有力支持。


針對各種疾?。ò⊿TAT3,CREB,PRAS40,p38,AMPK alpha,PTK2,Caspase 3信號傳導)涉及的許多關鍵靶標和信號傳導途徑的磷酸化進行準確、靈敏和快速的定性、定量分析。


5) 免疫球蛋白: 免疫球蛋白是指具有抗體活性的動物蛋白,主要存在于血漿中,也見于其他體液、組織和一些分泌液中。


對于一些疾病的研究,比如系統性紅斑狼瘡:多見于 lgG、lgA、IgM 的升高;類風濕性關節炎:多見于 IgG、IgM 的升高;巨球蛋白血癥:產生 IgM 的漿細胞惡性增生,血清中IgM可高達20g/L以上;IgE升高:常見于超敏反應性疾病,如過敏性鼻炎、外源性哮喘、枯草熱、慢性蕁麻疹,以及寄生蟲感染、急慢性肝炎、藥物所致的間質性肺炎、支氣管肺曲菌病、類風濕性關節炎等。



三、ELISA法的使用目的


ELISA方法按照使用目的可以分為兩類。第一類:生物大分子的定量,如抗體的穩轉、瞬和發酵過程的表達量監控,細胞因子的監控,體內抗體藥物的藥代動力學,藥效生物標志物的含量檢測和免疫原性測定等;第二類:親和力測定評價或者篩選。如雜交瘤的滴度測定,噬菌體展示的淘選篩選,體外抗體和對應靶點蛋白或細胞表面受體的親和力評價等。


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采用相同的實驗材料,不同的試劑配比以分別達到生物大分子定量和親和力評價的使用目的并進行對比的研究??贵w定量的目的是使所測的抗體樣品盡可能被捕捉到,從而進行準確的定量,而抗體結合活性檢測的目的是需要有完整的上下漸進線,S型曲線,其測得EC50即親和力數值(解離平衡常數)。



四、如何開展ELISA檢測?


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五、ELISA方法的檢驗標準


1)生物大分子定量方法學驗證


大分子的方法驗證主要根據現行的指導原則的要求進行方法驗證,驗證包括但不僅限于校正曲線、特異性(基質效應)/選擇性、準確度(批內、批間)、精密度(批內、批間)、耐用性、穩定性、線性、范圍、稀釋線性/鉤狀效應、定量限(靈敏度)、平行性等內容。


2)親和力測定驗證(相對結合活性方法學驗證)


親和力指得是抗體和靶點抗原的解離平衡常數,是一個非常重要的生物特性。在質量控制過程中,常用ELISA方法進行不同批次或者長期穩定性樣品的親和力評價。親和力一般來說是絕對值,但是由于生物實驗的復雜性,材料批次的替換可能會影響到樣品的親和力檢測準確性,常會引入一個默認質量屬性不會變化的對照品作為參比品,待測樣品和參比品一同進行檢測來抵消材料造成的偏差,并計算待測樣品相對于參比品的親和力(相對結合活性)。



六、ELISA法之自省


6.1顯色淡,靈敏度偏低

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6.2背景深,全部呈有色(通常的Elisa背景值OD<0.2)

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6.3重復性不佳,高CV值

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6.4出現白板,陽性對照不顯色

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參考文獻

Bioanalytical Method Validation Guidance for Industry.FDA,May 2018.

BERBIOANALYTICAL METHOD VALIDATION M10 draft February 2019.

《中國藥典》2020年版 第四部-生物樣品定量分析方法驗證指導原則